有活力的花粉是植物成功繁育的基本要素之一，也是形成种子的先决条件。能够长期保存有活力的花粉可为农业、林业和园艺领域创造育种和生产的灵活性，并实现跨越地理和季节限制的有效杂交，从而减少在授粉过程中雌雄植株同步开花的协调工作并确保授粉花粉的可用性。茄科植物花粉冷冻保存是全世界杂交种子生产行业的普遍做法，集中进行花粉生产对于确保知识产权、降低多年种子生产计划中的雌雄比例以及花粉生产风险管理等战略来说具有特别重要的意义。
花粉冷冻保存通常包括脱水、冷却、储存、解冻和再水合这一系列过程，每个过程的出错会严重影响最终的花粉质量，尤其是在工艺条件不理想的情况下，因此，监测花粉供应链上各个环节的花粉质量是十分必要的。目前，育种者和种子生产商已将花粉活力检测作为一种风险管理工具，以防止低质量授粉而导致的产量损失。
传统上进行花粉活力的评估多以显微镜为基础，如通过显微镜观察花粉大小的变化、荧光或非荧光染料染色后花粉新陈代谢活动或膜的完整性、萌发率以及花粉管的生长情况，此类检测中的数据分析通常通过人为量化细胞亚群或使用图像处理软件工具来完成。近些年，该领域逐渐引入了库尔特计数器和阻抗流式细胞仪（IFC），如瑞士Amphasys公司的Ampha Z32阻抗流式细胞仪就是专为分析花粉质量而研发的设备，其原理是通过检测流经微流控芯片的单个花粉粒的电阻抗特性来区分花粉活力。对比劳动强度、分析和动手耗时、结果可靠性、标准化程度和测试成本等方面，所有这些技术都各有优缺点。
本研究通过IFC活力法、体外萌发法以及花粉管长度分析，检测了同一批冷冻保存下的番茄和辣椒花粉样本，并对三种花粉质量分析方法进行了评估，以确定其是否适用于冷冻保存下的花粉的常规质量控制。结果表明：
i. Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC活力法）得到的花粉活性可以解释为花粉的发芽潜力，而体外萌发法则可在给定的发芽条件下直接量化花粉的发芽潜能，两种分析方法之间存在线性相关；
ii. 对自动化程度、通量、可重复性和再现性要求高的应用和行业来说，IFC活力法的理想的检测工具；
iii. 由于难以实现标准化，体外萌发法只适用于有一定时间和地域限制的研究；
iv. 由于通量低且可重复性差，通过花粉管长度分析花粉活性不能充分满足行业需求。
IFC数据与显微镜镜检数据的相关性
表1 花粉粒的不同形态亚型
分类 | 描述 | 图示 |
Aberrant 异常花粉 | 异常细胞与小孢子发育的中止有关，例如由于热胁迫导致的败育 |
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Aberrant 脱水花粉 | 这些花粉再水合并悬浮于萌发缓冲液中后，不能在形态上重建。可以清楚地看到类似 "咖啡豆 "的沟纹。 |
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Reconstituted, not germinated | 这类花粉粒通过再水合并悬浮在发芽缓冲液中，在形态上得以重组，但没有形成花粉管，如图1a–II |
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Reconstituted, pollen tube emerging | 这些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的长度短于花粉的直径 |
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Reconstituted, pollen tube longer than pollen diameter | 这些花粉粒形成了花粉管，但花粉管的长度短于花粉的直径 |
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图1 a. 显微镜下冷冻番茄花粉再水合过程中的形态重建（比例尺=50μm）：a-I)冷冻保存的番茄花粉，呈沟状形态；a-II）在95-99%相对湿度下再水合30min后的番茄花粉，重建为更球形的形态；b. IFC火力法可量化不同类型的茄科花粉：图上每个点对应一粒花粉，通过分析可在相位-振幅散点图中设置门控区分活化粉粒、死花粉粒和异常花粉粒；c .番茄花粉类群的量化：百分比柱状堆积图：显微镜镜检法；散点图：IFC活力法d. 辣椒和番茄花粉的样品活性（IFC活力法）与形态可重建花粉占比（显微镜镜检）的相关性分析。
IFC活力法vs.体外萌发法vs.花粉管长度分析
图2 IFC活力法、体外萌发法、花粉管长度分析三种花粉质量评估的比较
荷兰和瑞士两个试验点的20个样品的检测结果表明，IFC活力法与体外萌发法之间有很强的正相关性（图2a，番茄R2=0.77，辣椒R2=0.87）。其中，番茄和辣椒的体外萌发率分别比IFC活力平均低26%和19%。IFC活力和花粉管长度之间也存在正相关性，表明质量较高的花粉批次往往含有更多活力更强的花粉，从而形成更长的花粉管（图2b）。体外发芽率与花粉管长度间也发现了相似的结果（图2c）。
不同测量方法的再现性和重复性
IFC法的再现性非常高，花粉活性平均偏差为5%（图3a），可重复性强；体外萌发法再现率略低，平均偏差为9%，可重复性中等；花粉管进行活力评估的结果差异较大，重复性较差。
图3 不同试验方法的再现性和重复性
图4 发芽培养基渗透压对离体番茄花粉发芽率和花粉完整性的影响。高渗透压缓冲液降低了发芽率和花粉破裂的风险（比例尺 = 100 μm）。
本次研究结果表明，体外萌发法和IFC活力法均适用于分析冷冻保存的番茄和辣椒花粉的活性，且二者间具有高度的线性相关性。但值得注意的是，体外萌发法需要测试者严格遵循标准化测试方案，这包括缓冲液配方、测定温度和萌发时间，并明确不同花粉形态和发芽水平分类标准，相较而言，其更适用于特定研究地点的短期实验；而IFC活力法是一种可在任意地点由任何用户进行标准化操作的高通量检测方法，更适用于涉及操作人员和实验地点多、需要在更大时间窗口进行数据对比的测试项目中。
—— 参考文献 ——
Langedijk, N.S.M., Kaufmann, S., Vos, E. et al. Evaluation of methods to assess the quality of cryopreserved Solanaceae pollen[J]. Sci Rep 13, 7344 (2023).
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