众所周知，人类设计除草剂是为了杀死杂草，而在除草剂被反复使用的过程中自发的杂草除草剂抗性突变有巨大的选择优势，并往往会迅速主导杂草种群。导致杂草快速适应并表现抗性的两种主要机制是非靶点抗性(NTSR)和靶点抗性(TSR)。NTSR是指降解或物理上阻止活性成分达到其目标的过程，NTSR通常涉及多个基因，抗性通常是定量的。TSR具有更多的定性效应，例如对高水平除草剂的抗性为特征，并且可以追溯到改变除草剂靶标酶中单个氨基酸的大效应基因突变。虽然这对农民来说是个麻烦，但也为详细研究生物体如何快速响应强烈的选择提供了机会，尤其是新产生的突变和群体中已存在的突变都起到什么样的作用，哪个更重要？
近日，德国霍恩海姆大学、马普生物所、根特大学、美国宾夕法尼亚大学、奥地利科学院、弗雷德里希·米歇尔实验室以及巴斯夫公司的联合研究团队在《PNAS》在线发表了题为“Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass”的研究论文，介绍了研究团队通过组装大穗看麦娘( Alopecurus myosuroides )高质量参考基因组、分析已知抗除草剂等位基因变异以前向时间算法模拟发现TSR可能主要是由群体中已存在遗传变异引起的，而新的突变只起次要作用，此外TSR的出现很可能早于除草剂的应用。这对于杂草防治和除草剂的可持续利用具有积极的指导意义。
为了进行基因组测序和组装，研究团队从一个来源于德国的除草剂敏感群体（Appels Wilde Samen GmbH, Darmstadt）中选择了一个未携带已知ACCase、ALS或叶绿体psbA位点TSR突变的单株作为参考。前人通过福尔根光度法估计大穗看麦娘（A. myosuroides）基因组大小范围为4.2 Gb到4.7 Gb。为了更准确地估计所选单株的基因组大小，研究团队用黑麦（Secale cereale）作为参考标准，进行了流式细胞测量，估量单倍体基因组大小为3.56 Gb（图1A）。通过获得约90倍的基因组覆盖率的PacBio连续长片段（CLRs）、约44倍基因组覆盖率的Illumina PCR-free短读长以及约66倍基因组覆盖率的Hi-C染色质接触数据，研究团队用FALCON-Unzip的方法从头组装了大穗看麦娘的基因组，最终组装大小为3.53 Gb，由七个Super-scaffolds组成（图1B）。
组装的大穗看麦娘的基因组与其他杂草类相比，其染色体水平的线性关系很高，其中线性关系最高的是青稞（Hordeum vulgare）（图1C）。大穗看麦娘基因组的第2、3、4、5和7号染色体分别与青稞基因组第3、2、6、1和5号染色体有接近1：1的同义替换关系（图1D）。一个例外是大穗看麦娘基因组的1号染色体（807 Mb）包含了与青稞基因组第4、5和7号染色体呈线性关系的片段。
新组装的大穗看麦娘参考基因组使得评估欧洲范围内大穗看麦娘基因组的遗传多样性变得容易。研究团队对1123个大穗看麦娘单株进行了ddRAD-Seq测序，这些单株全部来源于田间疑似抗除草剂的个体，代表了来源于9个欧洲国家的44个种群，每个种群有22-24个单株。为了进行比较，研究团队还加入了三个除草剂敏感的参考种群（图2）。该实验平均测序深度为22.6倍，研究团队共鉴定到109924个单核苷酸多态性（SNPs）。最大似然法（ML）进化树分析显示，并未发现每个国家明确的系统进化情况（图2A）。
种群之间的总体遗传变异很低（FST范围：0.01至0.05，n = 47；图 2C），这与其他大穗看麦娘及其他野生杂草的研究类似。种群内个体的相关度很高（FIS=0.1；范围0.06至0.12）。在混合分析中，研究团队鉴别出7到9个祖先群（图2D），这与主成分分析（PCA）的聚类结果一致（图2B、D）。来自比利时（BE）、英国（UK）、卢森堡（LX）和法国（FR）的单株在遗传上非常相似并聚集在一起。来自荷兰（NL）的一个种群NL11330其他种群差异最大，FST值高达0.05（图2C）。来源德国（DE）的单株被分为三个亚群，其中一个亚群与瑞士（CH）的个体有共同的祖先，另一个与奥地利（AT）的个体有共同的祖先，第三个亚群是高度混杂的。波兰（PL）的种群与荷兰的NL0166种群有共同的祖先。综上，整个欧洲范围内存在清晰的大穗看麦娘地理群体结构，尽管目前的数据无法推断大穗看麦娘地理迁移的轨迹。
大部分关于除草剂耐药性分子机制的研究都集中于除草剂抑制酶基因的突变上，主要是ALS和ACCase编码基因，二者均可被一系列结构不同的化学物质抑制。为了了解特定位点突变和整体单倍型的多样性，研究团队扩增和分析了所有欧洲群体个体约13.2 kb的ACCase基因和约3.6 kb的ALS基因的片段。结果显示，最常见ACCase基因突变是Ile1781Leu，这与该替换突变的多效性相一致，该替换突变也会在没有选择压力的情况下产生而增加个体的适应性（图3 A-C）。TSR突变通常以显性方式作用，71.4%的ACCase基因TSR突变以杂合子的形式出现。
ACCase基因单倍型的PCA分析可将所有个体分为三个主要群体。为了更好地描述ACCase单倍型的多样性，研究团队进行了单倍型进化树和关系网分析（图3），结果显示，不同复杂性的单倍型网络 (图3 A-C）可能反映了每个种群所受到的选择压力。在群体中，有TSR突变的27个种群中只有4个种群含有单一的TSR单倍型，且单一TSR单倍型的基因频率很低，只有不到10%，从定义上来讲上，这反映了很可能存在早期的“硬扫荡”，但是其他23个种群中至少有两个TSR突变的单倍型，这说明“软扫荡”是正常的。在其中14个种群中，研究团队发现了来源于不同独立突变事件的不同TSR突变单倍型，而不是同一TSR突变被通过重组转移到其他单倍型上（图3D）。这一观察结果以一种无偏见的方式证实了早期探索性研究的推论。同时，研究团队发现了从同一单倍型的单个区域产生了两个或三个不同的TSR突变的7个单株（图3 B、C和E）。独立的(非重合）ACCase TSR单倍型的最大值是10。
使用除草剂的强大选择压力导致了杂草非常快速的抗性适应，但这有一个主要的问题：除草剂抗性主要由在使用除草剂之前群体中就已存在的遗传变异演变而来还是使用除草剂后出现的新的突变演变而来？为了回答这个问题，研究团队使用Hermisson & Pennings的方程，推导出适应性的概率（即通过TSR突变进化出的除草剂抗性）的期望值，以及这种适应性是由于群体中已存在遗传变异演化而来的可能性。结果显示，除草剂选择发生之前的TSR变异的有害选择系数对适应的概率只有很小的影响（图4）；TSR突变可能主要是由群体中已存在遗传变异引起的，而新的突变只起次要作用（图5）。
图4 不同场景适应性的模拟
综上所述，研究团队对不同情况下大穗看麦娘除草剂适应性的研究表明，随着人类对多样性的除草剂抗性机制的了解，很大一部分大穗看麦娘种群可能早已具备了针对目前使用除草剂的抗性和未来潜在新作用方式的适应性的的遗传变异，这对我们发展可持续的除草剂使用策略具有重要的指导意义。
Kersten S, Chang J, Huber C D, et al. Standing genetic variation fuels rapid evolution of herbicide resistance in blackgrass[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(16): e2206808120.
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