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2017年6月19日在RV Vettoria上采样。地表水由船泵通过在线热盐计 (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，测量温度和盐度，并通过在线荧光计测量总荧光(CycloPS7，Turner Design 连接databank）。然后，水流过采样装置（Cytobuy BV)，并依次通过Cytosense流式细胞仪（Cytobuy BV）和OnCyt在线流式细胞仪。

尽管对于自养微微浮游生物（蓝藻和微微真核生物），onCyt系统与传统流式细胞术的比较已有报道，而且对于异养微生物，onCyt系统已用于淡水系统，但其在海水中的应用仍需测试。因此，我们调整了染色方案，以适应onCyt在培养温度和时间方面的需要。为了保证测量的准确性，在含50 mM EDTA染色之前，样品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物（1%和0.05%最终浓度）。使用CytSense和onCyt获得的细胞计数与通过常规流式细胞术获得的计数显著正相关，如图所示，对于细菌，计数和亚群（高核酸，HNA和低核酸，LNA，图1c和d）都适用。

图1 通过CytoSense、onCyt和常规流式细胞术（Verse）获得的数据验证。

a）CytoSenseVs Verse蓝藻聚球藻计数的相关性b）onCyt Vs Verse总异养细菌计数的相关性c）通过onCyt获得的异养细菌的流式图d）通过Verse获得的异养细菌生的流式图

上船后，两台流式细胞仪在热盐分析仪之后连接到船上的采样线上。然后海水被分成两条线，一条通向CytSense，另一条通向onCyt。两台仪器同时采集了样本。

图2 显示了船的轨迹以及巡航期间收集的温度、盐度和荧光值。

两个低盐度区域很明显，一个靠近港口（Torre Annunziata），另一个位于受萨诺河（Sarno）影响的区域。第一个位于离海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二条河流与萨诺河相对应，萨诺河流经几个农村和城市地区，然后排入那不勒斯湾。a）温度，b）叶绿素荧光，c）航迹，d）盐度。箭头表示盐度较低的地点，Torre Annunziata（上图）和Sarno（下图）

细菌总浓度显示出这两个区域对应的峰值，第一个区域（Torre Annunciata）的最高浓度为1.5 x 106cell/ml，第二个区域（Sarno）的浓度为1.4 x 106cell/ml（图3）。尽管HNA在Torre Annunziata占主导地位，但HNA和LNA均存在于Sarno现场（未显示），表明采样轨迹沿线的群落组成发生了变化。事实上，HNA和LNA现在被识别为不同的细菌集群，最终代表了相同的较大分支，但属于不同的分类单元，而不像以前认为的那样，是更多（HNA）或更少（LNA）活性细菌。

图3 样本轨迹（左侧）和中异养细菌总浓度（右侧）cell/ ml

在Sarno现场采集的样本显示存在大肠杆菌，这是近期粪便污染的指标，但在Torre Annunziata现场（Milva Pepi，pers.Comm.）没有，这表明在仅根据细菌总浓度正确评估人类健康风险之前，进一步进行细菌分析的重要性。有毒藻类也是如此，其中单独的分类鉴定并不总是与必须使用其他适当的检测方法证明的毒素的存在相对应。

自养微生物组分也显示出两个区域之间的明显分离，蓝细菌聚球藻（Synechococcus）在南部地区占优势，而微微真核生物和隐藻在北部地区占优势（图4）。这也证实了先前的观察结果，表明原核生物（蓝藻）与大型真核生物（微微真核生物和隐藻）对不同的环境线索做出反应，后者通常负责总叶绿素的峰值（如荧光模式所示，图1b）。

自动高频流式细胞仪被证明是一种检测海洋微生物的成本效益高、速度快的方法，允许实时测量细胞浓度与环境因素相关性，以便解释和潜在地用作水质标志，并为进一步干预铺平道路。反过来，微生物群落，特别是异养细菌，似乎是环境条件变化的有用标志，需要考虑并纳入水质评估，如欧洲指令2008/56/EC所要求的，其目标是在2020年内达到所有欧洲水域的良好环境状态（GES）。

由于细菌细胞总数可能不会进一步反映致病性或毒性对人类健康的风险，因此必须谨慎行事。然而，流式细胞术可能是首次筛选的一种有价值的方法，实时预警潜在的关键位点，以便通过其他方法进一步监测和控制。